小时候，我们一定都曾羡慕魔术师的精湛表演——将一支花变成一束花，一条手帕变出一打手帕；也曾经面对眼前的生日蛋糕，许愿：希望眼前能出现两个蛋糕，或是更多。这些都是儿时的梦想，长大后发觉有点可笑，这种以少变多的戏法似乎是天方夜谭。不过，在生物学家的手中，有些梦想是可以实现的。比如将微量的DNA片段变得有1000万倍之多。这不是虚幻，而是现实，这正是PCR技术带给我们的惊喜。究竟何为PCR技术？又是怎样实现的呢？让我们慢慢揭晓。

首先，将时间追溯到1953年，Watson和Crick发现DNA双螺旋结构，这可谓生物史的一件大事，它开启了分子生物学的先河。之后又提出了有关DNA体内半保留复制的观点。能否对核酸进行体外扩增，科学家们进行了最早的设想。

 

本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，1971年，Khorana及其同事提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。

 

直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。1993年，Mullis等人因发明PCR而获得了诺贝尔化学奖。

 

PCR，Polymerase Chain Reaction，中文译为聚合酶链反应，是实验室广泛应用的体外核酸扩增技术。聚合酶是一种天然产生的酶，一种能催化DNA形成和修复的生物大分子。链反应是你要的DNA可以指数形式扩增。PCR扩增能力十分惊人。理论上讲，经30次循环反应，便可使DNA得到10⁹倍的增加。

PCR技术正是模拟体内DNA的复制。体内DNA复制需要DNA双链打开，RNA聚合酶合成一段引物，DNA聚合酶利用dNTP，以亲本DNA链为模板，通过碱基配对原则进行复制，得到两份DNA 拷贝。在体内，DNA复制只发生在细胞分裂的特定时期，而且只复制一次，有着严格的调控机制，才得以保证子代细胞中均有一份拷贝。而体外的DNA扩增可以“随心所欲”。一般意义上，我们可以得到109拷贝。在高温的条件下，作为模板的DNA双链会变性成为单链，当有合适的引物存在时，降低温度，引物就会与模板进行特异性配对，这样，如果再加上DNA聚合酶的催化作用，那么利用dNTP为原料就可以合成一份拷贝，然后再高温变性，低温退火，延伸，如此循环反复，可以使DNA片段以指数倍增加。所以，我们形象地将PCR仪称为“循环烤箱”，将加有模板、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+混合液的试管放入PCR仪中，设定程序。标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（一种耐高温的DNA聚合酶，在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：

有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

 

其实PCR技术诞生的背后还有一段故事。PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR技术从天才的构想到实现，真的是一人之功吗？PCR究竟是在什么样的环境下诞生的呢？让我们翻开历史真实的记忆，看看PCR背后的故事。

穆里斯原先是一名生物化学家，1972在加州大学伯克利分校取得博士学位，所学专长是有机合成。早期的他表现出年轻人桀骜不驯的性格，在那嬉皮的年代，吸食自制的迷幻药不算太稀奇，穆里斯也乐于此道。更让人难以想象的是，他在经历迷幻药之旅的过程中，居然想出了某个解释大爆炸宇宙学的理论，投稿到《自然》周刊，居然登了出来，他也因此通过了博士资格考，因为有文章发表在《自然》周刊的教授都不多，学生更是少见。至于他的博士论文，也是用“带点幽默的口语化写成。” 穆里斯的博士学位到手后，他来到得克萨斯州医学院，在那儿的心脏科找到了与其学位并不相称的工作，不久他回到加州湾区。1977年回到旧金山加州大学医学院的药物化学实验室，走的仍然不是学术的正途，也同样在不久以后，对新工作感到厌烦。1979年，穆里斯进了湾区一家名叫“西特斯”（Cetus）的私人生物技术公司任职。当年，生物技术公司还处于萌芽阶段，很少学术界人士愿意离开象牙塔的庇荫到私人企业工作，认为是学术生涯的终点。然而西特斯公司集结了一批有能力、有梦想的科学家，在自由开放的风气下，共同朝既定的目标前进。这和一般学院里各大教授及实验室的主持人关起门来各行其是的做法，相当不同。西特斯聘用穆里斯，是想借重他有机化学合成的专长，负责合成寡核苷酸。到了1985年春天，穆里斯已经在PCR技术研究中初见端倪，西特斯的高级主管对PCR的潜力信服，也开始担心消息外泄，而让旁人取得先机。3月里，他们送出了第一个专利申请，也准备在10月举行的美国遗传学会年会上报告成果，但之前必须将正式的论文写好投送才保险。他们决定写两篇文章，一篇是阐述关于PCR的理论，由穆里斯执笔先进发表，第二篇则集中在PCR技术的应用上，随后推出。穆里斯一再拖延论文的写作。到9月下旬另一篇应用文章写好投送时，穆里斯还没有动静。因此，第一篇提到PCR这个方法的论文，于1985年12月20日发表在《科学》周刊上，共有七位作者，日本人才木排头名，穆里斯则排第四。一直到了这年的12月，穆里斯才将论文写好，并投给《自然》周刊。但穆里斯忘了附上一封给编辑的信，当然也就没有说明该文与《科学》周刊上的那篇有何不同，结果遭到退稿。震惊之余，他转投《科学》周刊，结果仍然遭到退稿。这时的穆里斯把怒气转向公司，认为是公司的阴谋，想要窃取他发明PCR的功劳。至于PCR的概念是穆里斯的结晶，没有什么人有异议，只不过将概念实现的过程，就复杂得多了。穆里斯的文章两度遭退稿后，公司里有人建议他投给《酶学方法》杂志，主要是因为有人与该刊主编相熟，比较容易沟通，同时PCR的性质也适合该强调方法学的刊物。于是，穆里斯的文章终于得到发表，只不过整整晚了一年，到1987年初才问世。这篇文章只有穆里斯及另一位技术员两人挂名。为了表示他们并无意争功，西特斯的主管向冷泉港实验室的沃森（DNA双螺旋结构的发现人之一）推荐穆里斯在1986年5月举行的“人类分子生物学”专题研讨会中，报告PCR的原理及实际应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，分子生物学界有头有脸的人也都在场。结果他表现不错，建立了往后人们的印象：PCR是穆里斯一手发明的。在《酶学方法》的文章之前，冷泉港专题研讨会的专刊已经于1986年底出版，穆里斯挂头名。自此，PCR之名及其强大的应用性就广为人知了。然而，将PCR变成真正成熟技术的临门一脚，则是耐高温DNA聚合酶的引进。PCR的操作过程中，需要反复加热与降温的步骤，而前一次循环所使用的大肠杆菌DNA聚合酶在高温下就变性了，因此在每一次冷热循环之后，都要加入新鲜的聚合酶。这个做法不但烦琐，并且昂贵。按当时的价格，一次循环所需的聚合酶值1美元，30个循环下来就是30美元，循环更多次就更不得了。因此，1986 年春，穆里斯首度提出使用耐高温酶的想法。经过文献搜寻，果然找到了两篇有关文献，较早的一篇是在美国做的，另一篇则是俄国科学家的成果，以俄文发表。第一篇报道分离耐高温DNA聚合酶的工作，是一位来自台湾的年轻科学家钱嘉韵初试啼声之作。穆里斯虽然提出将Taq DNA聚合酶应用到PCR的建议，但当时并没有现成的可用，他得想办法自己分离。西特斯有全套分离蛋白质的装备，也有人愿意指导，但穆里斯是个拖延成性的人。等了几个月后，公司其他人只有自己动手，按着先前钱等人发表的步骤，三个星期就分离出纯化的Taq DNA聚合酶。1986年6月，才木首度将其应用于PCR，效果就好得惊人，可说是一战成功。Taq DNA聚合酶不但大大简化了PCR工作，同时专一性及活性都比之前使用的酶更强，背景杂讯也几乎都消除了，自此，PCR取得了完全的成功。

穆里斯于1986年9月离开了西特斯。他个人认为，PCR就是他一人发明的，得了诺贝尔奖的肯定后，也更听不得其他的声音。1991年12月，霍夫曼罗氏药厂据称以三亿美元购得了西特斯的PCR技术专利，西特斯公司也走进了历史。直到最近几年，由于之前钱嘉韵等人已经发表的工作，Taq DNA聚合酶的专利权遭到挑战，连带使PCR的专利也受到影响，不过那又是另外一个故事了。

 

我们暂且抛开这些有关PCR专利等世俗之争，让我们正视这项惊人的技术，看看它为我们带来了什么。以少变多，这是其一，也就是强大的扩增能力，具有放大镜的功用，火眼金睛，就如同显微镜在细胞学中的举足轻重作用一般，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断，可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定；其二，则是它的快速。它扩增效率之高就象核裂变的“链式反应”那样，过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成；其三，在于它扩增的特异性。正是由于我们所加入的引物是与DNA模板特异配对的，所以它所扩增的DNA 片段都是我们期望得到的特异性片段。在PCR 仪问世之后，可以进行自动化操作，更加方便了，也进一步扩展了它的功用。它集特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点于一身，已经成为实验室研究DNA分子必不可少的工具。